Die Rolle des SV 40 17kDa Tumorantigens in der produktiven SV 40 Infektion und der SV 40-vermittelten Zelltransformation

Die Rolle des SV 40 17kDa Tumorantigens in der produktiven SV 40 Infektion und der SV 40-vermittelten Zelltransformation

von: Katja Scheidig

Verlag für Wissenschaft und Forschung, 1999

ISBN: 9783897000797 , 151 Seiten

Format: PDF, OL

Kopierschutz: DRM

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Preis: 29,90 EUR

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Mehr zum Inhalt

Die Rolle des SV 40 17kDa Tumorantigens in der produktiven SV 40 Infektion und der SV 40-vermittelten Zelltransformation


 

1 EINLEITUNG

12

1.1 Das Simian Virus 40 (SV40)

13

1.2 Vermehrungsszyklus des SV40 Virus

14

1.2.1 Produktive Infektion von SV40 permissiven Zellen

14

1.2.2 Nicht produktive, abortive Infektion von nicht permissiven Zellen

15

1.3 Struktur und Funktionen der viralen Tumorantigene

15

1.3.1 Das große SV40 Tumorantigen (T-Ag)

15

1.3.2 Das kleine SV40 Tumorantigen (t-Ag)

23

1.3.3 Das SV40 17kDa Tumorantigen

24

2 PROBLEMSTELLUNG

26

3 MATERIAL

29

3.1 Versuchstiere

29

3.2 Zellinien

29

3.2.1 Affennierenzellinien (SV40 permissiv)

29

3.2.2 Humane Zellinien (SV40 semipermissiv)

30

3.2.3 Rattenzellinien (SV40 nicht permissiv)

30

3.2.4 Mauszellinien (SV40 nicht permissiv)

31

3.2.5 Insektenzellen

31

3.2.6 Viren

31

3.2.7 Bakterienstämme

32

3.3 Antikörper

32

3.3.1 Monoklonale Antikörper, die gegen SV40 Tumorantigene gerichtet sind

32

3.3.2 Polyklonale Antikörper, die gegen SV40 Hüllproteine gerichtet sind

32

3.3.3 Polyklonales Peptidantiserum, das gegen den Carboxyterminus von 17kT gerichtet ist

33

3.3.4 Sekundäre Antikörper

33

3.4 Nukleinsäuren

33

3.4.1 Plasmide

33

3.4.2 Oligonukleotide

35

3.5 Enzyme

36

3.6 Chemikalien und Biochemikalien

37

4 METHODEN

39

4.1 Zellkultur und zellanalytische Techniken

39

4.1.1 Zellkultur von Zellinien

39

4.1.2 Passagieren von adhärent und in Suspension wachsenden Zellkulturen

39

4.1.3 Bestimmung der Zellzahl

39

4.1.4 DNA Transfektion

40

4.1.5 Transiente Kotransfektion von Expressionsvektoren in CV1 Zellen mit der Kalziumphosphatpräzipitationsmethode

40

4.1.6 Transiente Transfektion von eukaryontischen Expressionsvektoren in Zellen und stabile Transfektion von Baculovirusvektoren in Insektenzellen

41

4.1.7 Etablierung DNA-rekombinanter Zellinien

41

4.1.8 Einfrieren von Zellen (Kryokonservierung)

42

4.1.9 Auftauen von Zellen

42

4.2 Virologische Techniken

43

4.2.1 Infektion von Affennierenzellen

43

4.2.2 Abortive Infektion von Nagetierzellen

43

4.2.3 Softagarklonierung

43

4.2.4 Transfektion viraler DNA in Affennierenzellen

44

4.2.5 Herstellung eines 17kT exprimierenden Baculovirus durch Transfektion

44

4.2.6 Herstellung eines SV40 Virusüberstandes

44

4.2.7 Aufkonzentrierung von Virusüberständen

45

4.2.8 Bestimmung der SV40 Infektionseffizienz

45

4.2.9 Indirekte Immunfluoreszenz SV40-infizierter Zellen oder stabil exprimierenden Zellinien

45

4.3 Proteinanalytische Techniken

46

4.3.1. (35S)-Markierung von Proteinen

46

4.3.2 (32P)-Markierung von Proteinen

47

4.3.3 Ernte von eukaryontischen adhärenten Zellen

47

4.3.4 Gesamtzellextraktion

48

4.3.5 Proteinbestimmung nach Bradford

48

4.3.6 Messung der eingebauten Radioaktivität bei radioaktiv markierten Gesamtzellysaten durch Szintillationszählung

48

4.3.7 Aufarbeiten der transfizierten Zellen für den Luziferasetest

49

4.3.8 Immunpräzipitation von Proteinen aus Gesamtzellysaten

49

4.3.9 Vorbereitung der Proben für die Analyse in der SDS-PAGE

50

4.3.10 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)

50

4.3.11 Nachweis von radioaktiv markierten Proteinen durch Fluorographie

51

4.3.12 Nachweis von Proteinen durch direkte Anfärbung im Gel

51

4.3.13 Nachweis von Proteinen im Western Blot

51

4.4 Immunologische Techniken

56

4.4.1 Herstellung eines 17kT-spezifischen Peptidantiserums

56

4.4.2 Aufbereitung der Proben für die Immunisierung

57

4.4.3 Immunisierungsstrategie

57

4.4.4 Immunisierungsschema

58

4.4.5 Blutentnahme und Präparation des Serums

58

4.4.6 Austesten der Mausantiseren mit Dot Blot Analyse

58

4.5 DNA-analytische Techniken

59

4.5.1 Herstellung transformationskompetenter Bakterienzellen mit der Mehrionentechnik

59

4.5.2 Transformation von Bakterien mit Plasmid DNA

60

4.5.3 Reinigung von Nukleinsäuren

60

4.5.4 Konzentrationsbestimmung von DNA

62

4.5.5 Restriktionsendonukleolytische Spaltung von DNA

62

4.5.6 Gelelektrophoretische Auftrennung von DNA

62

4.5.7 DNA Elution aus Agarosegelen

63

4.5.8 Reinigung und Konzentrierung von DNA Lösungen

63

4.5.9 Klonierung von DNA

64

4.5.10 DNA Amplifikation durch die Polymerasekettenreaktion (PCR)

65

4.5.11 DNA Sequenzierung

67

4.5.12 Elektrophorese der sequenzierten DNA

68

4.5.13 Radioaktive Markierung von DNA

68

4.6 RNA-analytische Techniken

71

4.6.1 Isolierung von Gesamt RNA aus Zellkulturzellen

71

4.6.2 Quantifizierung der RNA

71

4.6.3 Gelelektrophorese der RNA

71

4.6.4 Northern Blot Analyse

72

5 ERGEBNISSE

74

5.1 Nachweis des SV40 17kDaTumorantigens (17kT) in SV40-transformierten Zellen

74

5.1.1 Der monoklonale Antikörper PAb416 erkennt 17kT

74

5.1.2 Expressionsmuster des 17kT Proteins in SV40-transformierten Zellen

77

5.2 Herstellung eines 17kT-spezifischen Peptidantiserums

79

5.2.1 Das Antiserum KS2 erkennt 17kT Protein aus einer SV40- transformierten Zellinie

79

5.2.2 Spezifische Erkennung des 17kT Proteins in transient transfizierten Affenzellen durch die Antiseren KS1 und KS2

80

5.3 Nachweis des SV40 17kT Proteins in produktiv SV40- infizierten Zellen

82

5.4 Konstruktion eines 17kDa Tumorantigen-defizienten (17kT-) SV40 Virus

84

5.4.1 Auswahl der Punktmutationen für die in vitro Mutagenese zur Herstellung eines 17kT defizienten SV40 Virus

85

5.4.2 Prinzip der in vitro Mutagenese durch Polymerasekettenreaktion (PCR)

87

5.4.3 Klonierung der SV40 Doppelmutante

89

5.4.4 Vermehrung der SV40 Virusmutante in Affennierenzellen

89

5.4.5 Analyse der amplifizierten Virusmutanten

89

5.5 Vergleich von SV40 Wildtyp mit der SV40 (17kT-) Mutante in der produktiven Infektion

92

5.5.1 Expression der viralen RNA in SV40 Wildtyp- und SV40 (17kT-)- infizierten TC7 Zellen

92

5.5.2 Expressionsmuster der viralen Proteine in SV40 Wildtyp- und SV40 (17kT-)-infizierten TC7 Zellen

94

5.5.3 Akkumulation der viralen DNA in SV40 Wildtyp- und SV40 (17kT-)-infizierten TC7 Zellen

96

5.5.4 Virale DNA Syntheseraten in SV40 Wildtyp- und SV40 (17kT-)-infizierten TC7 Zellen

97

5.5.5 Virusfreisetzung in SV40 Wildtyp- und SV40 (17kT-)-infizierten TC7 Zellen

98

5.6 Einfluß von 17kT auf den Verlauf der produktiven Infektion

100

5.6.1 Etablierung stabil 17kT exprimierender Zellinien

100

5.6.2 Analyse der Phänotyps der 17kT stabil exprimierenden TC7 Zellinien

100

5.6.3 Einfluß von 17kT auf die frühe Phase der produktiven SV40 Infektion

101

5.6.4 Analyse der T-Ag mRNA Menge in der frühen Phase der Infektion

101

5.6.4 Analyse der Proteinmenge von T-Ag in der frühen Phase der Infektion

103

5.6.5 Analyse der Proteinsyntheserate von T-Ag und t-Ag in der frühen Phase der SV40 Infektion

104

5.7 Die Rolle von 17kT bei der Transaktivierung des frühen SV40 Promotors

105

5.8 Interaktion von 17kT mit dem Retinoblastomagenprodukt (Rb)

107

6 DISKUSSION

109

6.1 Expression einer autonomen aminoterminalen Domäne des großen Tumorantigens – eine gemeinsame Strategie der DNA Tumorviren?

109

6.1.1 Entdeckung 17kT-verwandter Proteine bei anderen DNA Tumorviren

110

6.1.2 Evolution der DNA Tumorviren

112

6.2 Die Rolle des SV40 17kDa Tumorantigens in der SV40-vermittelten Zelltransformation

113

6.3 Die Rolle des SV40 17kDa Tumorantigens in der SV40 Infektion

116

6.3.1 Nachweis der 17kT Expression in infizierten Zellen

116

6.3.2 Vergleich des SV40 Wildtypvirus mit der SV40 (17kT-) Deletionsmutante in der produktiven SV40 Infektion

116

6.3.3 Einfluß von 17kT auf den Verlauf der produktiven Infektion

118

6.3.4 Transkriptionelle Aktivierung und Repression des frühen SV40 Promotors in der viralen Infektion

121

6.3.5 Mechanismen der transkriptionellen Aktivierung

123

7 ZUSAMMENFASSUNG

126

8 LITERATUR

128

9 ABKÜRZUNGEN

144

DANKSAGUNG

148